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凯氏定氮法测定蛋白质分为哪几个过程

更新时间:2018-01-15  |  点击率:10197
蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的*来源,具有糖类和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。在检验食品中蛋白质时,通常是先检定出食品中的总氮量,然后乘以蛋白质换算系数,以此得到蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出,至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸取和滴定过程。

 

原理

向样品中加入浓硫酸和催化剂,充分混匀,然后加热消化分解,样中碳和氢被氧化成二氧化碳和水,其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸取后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。

 

样品消化

浓硫酸具有脱水性和氧化性,可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水,蛋白质会分解为氨,然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点,一般情况下,纯硫酸的沸点在340 ℃左右,但是在添加硫酸钾后,可提高至400 ℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾,否则会因为温度过高,使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外,还可以指示消化终点的到达,有机物全部消化*后,溶液呈现清澈的蓝绿色,硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。

 

蒸馏

消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出,影响测定结果,所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐,需要足够的碱液使结合态的氨*反应并释放出来,这个过程中的氢氧化钠一定要过量,过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀,氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成,可用奈氏试纸法,NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。

 

吸取

加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸取,硼酸有吸取氨的作用,又因其呈微弱酸性,不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸取液对氨的吸取作用减弱,从而造成损失,故一般不超过40 ℃。

 

滴定

待吸取*后,用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定,滴定液的浓度直接影响结果的准确性,必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色,滴定终点时液体呈灰色。

 

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